रिमोट कंट्रोल सिस्टम की दमन क्षमता दो अलग दृष्टिकोण में इस प्रकार दूर प्रदर्शन किया गया है । पहले दृष्टिकोण में, lac दबानेवाला बंधन साइटों Dnmt1 जीन के अंतर्जात प्रमोटर में डाला गया । दूसरे दृष्टिकोण में, जो इस प्रोटोकॉल द्वारा सिफारिश की है, दबानेवाला बंधन साइटों को एक डाउनस्ट्रीम intron में सम्मिलित किया गया था और इस प्रकार रिमोट कंट्रोल के आवेदन को सरल बनाने के लिए प्रविष्टि द्वारा प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने के संभावित जोखिम से बचने के लिए प्रणाली. दोनों दृष्टिकोण सफल दमन में हुई (चित्रा 2ए, बी और चित्रा 3a-C)10। Dnmt1 अभिव्यक्ति प्रमोटर आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर अनियमित स्तरों के 15% के लिए दमन किया गया था (चित्रा 2ए) । इस तंग दमन IPTG (चित्रा 2ए) के अलग मात्रा के साथ चूहों के इलाज के द्वारा एक खुराक पर निर्भर तरीके से उलट गया था । मनाया Dnmt1 दमन immunostaining द्वारा प्रोटीन स्तर पर मान्य किया गया था (चित्रा 2बी). हम Dnmt1के बीच Dnmt1 अभिव्यक्ति में कोई उल्लेखनीय अंतर का पालन नहीं किया+/+ और Dnmt1lo/लो चूहों, पुष्टि कि हमारे lac ऑपरेटर प्रविष्टि सामांय प्रमोटर बाधित नहीं था समारोह10. intron आधारित दृष्टिकोण कम प्रतिलेखन बढ़ाव (चित्रा 3ए, बी)10द्वारा प्रतिलेखन शुरू साइट के कई किलोबेसेस डाउनस्ट्रीम स्थित ऑपरेटरों से अधिक से अधिक ९०% दमन हासिल किया । इस इनट्रॉन आधारित एप्रोच को सात अतिरिक्त दमदार प्रमोटरों (चित्रा 3सी) पर आगे मान्य किया गया । परीक्षण किए गए सभी प्रवर्तकों से निरपवाद रूप से कडी दमन किया गया । अवशिष्ट अभिव्यक्ति के स्तर और प्रवर्तकों की ताकत के बीच कोई संबंध नहीं देखा गया था, सुझाव है कि हमारे intron के दमन की क्षमता आधारित दमन प्रणाली मजबूत प्रमोटरों हम परीक्षण के सभी के transcriptional शक्ति से अधिक है ( चित्रा 3 ग) ।

रिमोट कंट्रोल सिस्टम की वीवो यूपरेग्लेशन कैपेबिलिटी में Dnmt1 जीन पर भी प्रदर्शन किया गया । हम Dnmt1 प्रमोटर में tet ऑपरेटर की दो प्रतियां शुरू की, एक साथ लाख ऑपरेटर दृश्यों के साथ, या तो upregulation या downregulation के आधार पर जो effector प्रोटीन मौजूद है के लिए अनुमति देते हैं । Dnmt1 व्यंजक का दमदार अपरेग्लेशन और डाउनरेगुलेशन, परिमाण के दो आदेशों (10% से ६५०%) के करीब, ईएससीएस में प्राप्त किए गए थे जिसमें संशोधित अंतर्जात Dnmt1 एलील (Dnmt1LGT) (चित्र 4ए)10 . दोनों नियमों को पूरी तरह से पलटवाँ और IPTG और डॉक्स उपचार, क्रमशः (चित्रा 4ए) द्वारा inducible थे । हम अगले माउस जर्मलाइन में Dnmt1LGT संशोधन शुरू की दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo upregulation क्षमता में परीक्षण । यकृत, प्लीहा, और गुर्दे से Dnmt1 का प्रबल अपगुलेशन देखा गया, जबकि हृदय में कोई detectable अपरूग्लेशन नहीं पाया गया (चित्र 4ख)7. Dnmt1 के सेल चक्र पर निर्भर अभिव्यक्ति पैटर्न और दिल में प्रफलन कोशिकाओं की कमी इस प्रेक्षण10,५६आबाद हो सकता है । यह देखना है कि क्या इस सीमा उत्प्रेरक या उसके बाध्यकारी साइटों की संख्या की अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि से दूर किया जा सकता है ।

चित्रा 2 : Vivo में LacIGY दबानेवाला द्वारा Dnmt1 का दमन । (क) Dnmt1 प्रमोटर में सम्मिलित की गई एलएसी प्रचालक (एलओ) के साथ चूहों को, जिसमें अथवा बिना किसी LACIGYकी अभिव्यक्ति के, आईपीटीजी की विभिन्न खुराकों के साथ उपचार किया गया था । qRT- Dnmt1 अभिव्यक्ति का पीसीआर विश्लेषण IPTG उपचार द्वारा Vivo में Dnmt1 दमन की खुराक पर निर्भर उलटा पता चलता है । प्रत्येक बार किसी भिंन माउस से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । (ख) चूहों के कोलोनिक भभक में Dnmt1 प्रोटीन की प्रतिरक्षा के लिए 3 सप्ताहों के लिए १६० मिमी आईपीटीजी के साथ या बिना पीने के पानी उपलब्ध कराया गया । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3 : Vivo में और रिमोट कंट्रोल सिस्टम द्वारा विभिन्न प्रमोटरों के विट्रो दमन में । (ं) एक विलिण-mKate2 ट्रांसजेनिक माउस (VilmKate2) में विलिं प्रमोटर के इनट्रॉन अनुप्रवाह में रेपरोन अनुक्रम (आर *) का प्रारंभिक संस्करण डाला गया था । qRT-पीसीआर के साथ या बिना Lacigy दमित चूहों की छोटी आंत में mKate2 अभिव्यक्ति का विश्लेषण दिखाया गया है । प्रत्येक बार किसी भिंन माउस से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) छोटी आंत के साथ और बिना lacigy अभिव्यक्ति के confocal mKate2 छवियां । (ग) विभिन्न प्रमोटरों और एक ल्यूसीफ्रास रिपोर्टर के बीच छह सममित लाख प्रचालक सम्मिलित किए गए थे । रिपोर्टर्स (५० एनजी/well में ९६-well थाली) और दबानेवाला plasmids एक 1:1 दाढ़ अनुपात में nih/3t3 कोशिकाओं में transiently शुरू किए गए थे । ल्यूसिफेर्स वैल्यू ट्रांसफेक्शन के बाद 24 एच का आकलन किया गया । इन विट्रो डेटा में luciferase अभिव्यक्ति का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व lacigyमें गैर कार्यात्मक laci (nflaci) व्यक्त उन लोगों के सापेक्ष कोशिकाओं को व्यक्त । टी परीक्षण सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । *p ≤ ०.०५, * *p ≤ ०.०१. यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4 : नीचे और/या Dnmt1 अभिव्यक्ति में विट्रो और vivo में upregulation । (क) पूरा रिमोट कंट्रोल सिस्टम जीन लक्ष्यीकरण और इलैक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोणों द्वारा सुसंस्कृत ईसीएस में तैयार किया गया था । Dnmt1 अभिव्यक्ति का अधिकतम दमन कोई इलाज के साथ प्राप्त किया गया था, जबकि अधिकतम सक्रियण दोनों IPTG और डॉक्स उपचार द्वारा प्राप्त किया गया था । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । *p ≤ ०.०५, * *p ≤ ०.०१ (वेल्च टी-टेस्ट) । (ख) विवो में दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली द्वारा Dnmt1 के सक्रियकरण में, जैसा कि रिमोट कंट्रोल चूहों से विभिन्न ऊतकों में Dnmt1 प्रोटीन का प्रतिरोदन करके दर्शाया गया है । एलजीटी एले में lac ऑपरेटर और tet उत्प्रेरक बाइंडिंग साइटों को शामिल करने के लिए Dnmt1 के प्रमोटर संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है । चूहों को एक महीने के लिए सामान्य या डोक्स युक्त आहार (५००० मिलीग्राम/किग्रा Doxycycline Hyclate) के साथ उपचार किया गया । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़ा 1 : मुरीन Dnmt1 intron 1 में लैंडिंग पैड प्रविष्टि का उदाहरण । (क) क्वाड्रास एट अल (२०१५)31से रूपांतरित अवतरण पैड प्रविष्टि के लिए डीएनए टेम्पलेट की योजनाबद्ध । विषमप्ररूपी Loxp साइटों, JT15 और Lox2272, एक छोटी स्पेसर अनुक्रम (सपा) से अलग कर रहे है और ६०-डीएनए के बीपी द्वारा हर तरफ flanked कि लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्र के लिए समजातीय है । (ख) निम्नलिखित sgRNA का उपयोग Dnmt1 intron में लैंडिंग पैड प्रविष्टि के लिए नमूना डीएनए टेम्पलेट: CTAGTACCACTCCTGTACCG (जो रिवर्स किनारा लक्ष्य) । चयनित intronic क्षेत्र bioinformatically १.१ कदम से सूचित किया गया था, और sgRNA CRISPOR29का उपयोग कर की पहचान की गई थी । (ग) लैंडिंग पैड के संमिलन का आकलन करने के लिए पीसीआर प्राइमर डिजाइन का उदाहरण । पीसीआर प्राइमरों को अंतर्जात Dnmt1में एकीकरण की पुष्टि करने के लिए टेम्पलेट के समजातता बाहों के बाहर डिजाइन किए गए थे । वाइल्डटाइप PCR amplicon है २१३ bp; लन होने पर यह २९१ बीपी हो जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।